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抗體的生物素化標記

河北快三开奖结果遗漏 www.tzkkx.com 基本原理

      本法可使抗體或其它蛋白質的ε-氨基通過手臂與?;納鎪毓布勱岷?。其后,生物素化的分子可應用酶標-親和素或熒光染料-鏈霉親和素復合物來檢測。小分子的水溶性生物素對細菌蛋白鏈霉親和素具有高度親和力是本法的設計基礎。

試劑及儀器

l         NHSB:N-羥基琥珀酰亞胺生物素(有商品供應)

l         0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液,pH 8.0(見附錄)

l         雙蒸水(注意去除游離氨基),用以配制碳酸氫鈉緩沖液或硼酸緩沖液

l         DMSO(二甲亞砜,有毒試劑)

l         1 mol/L NH4Cl

l         疊氮鈉(有毒試劑)

l         PBS(見附錄)

l         10g/L牛血清白蛋白(W/W)PBS液

l         分子篩柱(如G25)

l         電磁攪拌器

l         透析袋(MW CO 8000)

l         鋁鉑

l         微量移液器

 

操作步驟

1.將待生物素化的蛋白質用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6)稀釋到1mg/ml,一般實驗室應用的生物素化體積為1-2.5ml;

2.交互用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6),對蛋白質充分透析;

3.用1ml DMSO 溶解NHSB 1mg;

4.向1ml蛋白質溶液(即含蛋白質1mg)加入120μl NHSB溶液(即含NHSB 120 μg);

5.在室溫下持續攪拌,保溫2-4小時;

6.加入9.6μL1 mol/L NH4Cl (每25 μg NHSB 加1 μl),在室溫下攪拌10分鐘;

7.在4℃,對PBS充分透析,以除去游離的生物素;

8.將樣品上1ml的分子篩柱,以PBS緩慢洗脫,收集1ml/管,蛋白質在1-3ml之間洗下;

9.最后,樣品加入疊氮鈉(終濃度0.5g/L)及1.0g/L BSA。將結合產物置4℃,避光保存,亦可加入50%重蒸甘油,置―20℃保存。

質量監測

與酶-或熒光染料-結合的親和素、鏈霉親和素或中和親和素(neutravidin),通過標準方法(Western blotting 或免疫熒光染色法)測定交聯率。

實驗要點及說明

1、如在反應混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在,會抑制標記反應。因此,蛋白質在反應前要對0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L硼酸緩沖液充分透析;

2、所用的NHSB及待生物素化蛋白質之間的分子比按蛋白質表面的ε-氨基的密度會有所不同,選擇不當則影響標記的效率,應先用幾個不同的分子比來篩選最適條件;

3、用NHSB量過量也是不利的,抗原的結合位點可能因此被封閉,導致抗體失活;

4、由于抗體的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此時可加入去污劑如Triton X-100,Tween 20等。

5、當游離ε-氨基(賴氨酸殘基的氨基)存在于抗體的抗原結合位點時,或位于酶的催化位點時,生物素化會降低或損傷抗體蛋白的結合力或活性。此時,應試用其它交聯方法;

6、生物素還可能與不同的功能基團,如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基,也可與糖基共價結合(詳見參考文獻1);

7、交聯反應后,應充分透析,否則,殘余的生物素會對生物素化抗體與親和素的結合產生競爭作用;

8、在細胞的熒光標記實驗中,中和親和素的本底低,但由于鏈霉親和素含有少量正電荷,故對某些細胞可導致高本底。

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