歡迎訪問北京德博生物技術有限公司官方網站!

逆轉錄病毒介導的DNA轉染

河北快三开奖结果遗漏 www.tzkkx.com     反轉錄病毒作為基因轉移的載體有如下特點:①反轉錄病毒感染細胞的效率高,基因轉移率在10%-100%;②病毒基因轉移能將外源基因整合到宿主細胞基因組中外源基因能穩定存在而不丟失;③外源基因整合的拷貝數一般只有一個;④反轉錄病毒只選擇感染分裂細胞;⑤病毒可容納外源基因的DNA長度為<8Kb。
反轉錄病毒載體的結構:已切除了病毒的結構基因gag,大部分pol和env,包括兩側的LTR,被選擇(標記)基因和目的基因插入的多聚位點所取代,同時還帶有包裝信號ψ。
(一)可產生特異性逆轉錄病毒細胞系的建立
  1、逆轉錄病毒載體進入包裝細胞系
    從細胞質粒中產生感染性病毒包括將質粒導入包裝細胞系,可從穩定感染細胞中選擇病毒產生細胞或用一個包裝細胞系暫時產生的病毒感染另一種有不同包裝的細胞系,從中選擇病毒的產生細胞。
  1.1準備工作(用品):
(1)適當的包裝細胞系及培養液
(2)大多數包裝細胞系為鼠源的,含有鼠“Helpe病毒”,此病毒可幫助被去除某些功能結構基因的逆轉錄病毒復制,并包裝于蛋白衣殼中。
(3)逆轉錄病毒質粒DNA常構建成含有抗藥基因neo新霉素基因的載體。
(4)Hepes-緩沖液(HeBs)
(5)2mol/L CaCL2
(6)含血清及不含血清培養液
(7)HeBs 15%甘油(HeBs/甘油)
(8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素對抗物)
(9)10%~15%DMSO
(10)10cm、6cm培養皿
(11)24孔、6孔培養板
(12)克隆環
  1.2操作步驟:
(1)轉染前,10cm培養皿中接種大約10%~20%皿底面積的包裝細胞。
(2)將10μg含抗藥基因的逆轉錄病毒質粒DNA加入0.5mL HeBs中,加入32μL 2mol/L CaCL2,輕振動,加蓋30分鐘,室溫下培養45分鐘,直到小的、模糊的蘭色沉淀產生。
(3)從包裝細胞中棄去舊液,輕輕滴入HeBs-DNA沉淀于細胞培養皿中心,使細胞接觸DNA20分鐘,每10分鐘輕輕搖動培養皿,使溶液均勻,加入10mL培養液,并于37℃放置4小時。
(4)完全吸出培養液,逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油,放回培養箱繼續培養,如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包裝細胞系,需培養3.5分鐘,若為Q2bn包裝細胞系,需培養1.5分鐘,或根據不同包裝細胞選用不同時間。迅速棄去HeBs/甘油,用10mL培養液洗2次,加入含有血清的5ml培養液培養18~24小時。
(5)取出培養液用0.45μm過濾,可獲得含有短期產生病毒的培養上清,-70℃或-80℃貯存,或立即用于其它包裝細胞系的感染。
(6)加入10ml培養液于上述已感染的細胞,繼續培養2~3天,繼續步驟10。
(7)另一包裝細胞受感染前1:10或1:20傳代。
(8)倒去包裝細胞的培養液,加入步驟5獲得的病毒。方法如下:
對于10cm培養皿,將0.1至1.0mL病毒貯存液稀釋至3~5mL的終體積,加入800mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L,培養1小時以上。
(9)若10cm培養皿加入10mL培養液,6mL培養皿中應加入4mL培養液,培養2~3天。
(10)步驟6或步驟9得到的感染細胞,2~3天后按1:10或1:20傳代,接種于選擇培養液培養3天,更換培養液,繼續培養3~4天,直至克隆出現。
(11)用克隆環挑出分離的克隆,每個克隆接種24孔板或6孔板中的二個孔,生長至50~90%底部面積。
(12)倒去培養液,換入1倍體積的培養液,繼續培養1~3天,收取培養液,馬上滴定,或者貯存于-70℃或-80℃。
(13)繼續傳代克隆細胞直到能被冷凍或被鑒定,若病毒產生克隆被鑒定,10%~15%DMSO?;ぜ烈旱炒嫦赴?。即產生病毒細胞系建立。
  2、病毒滴度鑒定
在分離產生病毒的克隆后,需進行病毒滴度的測定,常用的方法是用病毒感染目的細胞,可根據載體RNA或蛋白的出現粗略定量分析。

0512-62512025

河北快三开奖结果遗漏